Bagaimana membaca hasil RT PCR?

Pendahuluan
Real time PCR atau disebut sebagai quantitative PCR atau q-PCR merupakan suatu metode yang sebenarnya sederhana dan cukup elegan dalam menentukan jumlah target sekuens atau gen yang deteksi dalam sampel. Tetapi hati-hati justru karena simpel jangan sampai kita salah dan berlebihan dalam mengartikan atau membaca hasilnya.


RT PCR berbeda dengan PCR biasa, dimana pada RT PCR, produk gen yang diamplifikasi di monitor jumlahnya secara "real time" berdasarkan waktu, atau suatu titik tertentu pada garis waktu. Makin awal atau makin cepat  jumlah kopi target gen tertentu maka akan makin awal pula fluoresensi yang terobservasi atau termonitor. Bedanya pada PCR biasa jumlah produk amplifikasi hanya dihitung pada saat selesai atau pada titik waktu terakhir.

Zat kimia untuk mendeteksi sekuens atau urutan basa RNA
Ada dua jenis zat kimia untuk deteksi produk PCR:
1. fluorogenic 5' nuclease sering pada produk komersil disebut sebagai TaqMan
2. zat pewarna Sybr green

TaqMan dapat dipakai pada beberapa tipe penghitungan sekuens basa:
- One step RT PCR untuk menghitung RNA
- Two step RT PCR untuk menghitung RNA
- Penghitungan DNA/ cDNA dengan metode: diskriminasi allelic atau Plus/Minus mempergunakan IPC

-- bersambung  besok --

Oksidasi Biologi

Apa itu oksidasi biologi?

Oksidasi biologi pada prinsipnya adalah peristiwa yang terjadi atas dasar  dua mekanisme yaitu oksidasi dan reduksi. Dimana oksidasi merupakan pengeluaran elektron dan sebaliknya reduksi adalah menerima elektron. Setiap oksidasi akan disertai reduksi. Prinsip ini berlaku bagi sistem biokimia secara umum.

Meskipun  "oksidasi" mempunyai arti sebagai suatu proses yang didalamnya terdapat peran serta oksigen. Namun pada  proses oksidasi belum tentu  terdapat keterlibatan molekul oksigen, misalnya oksidasi yang terjadi dengan bantuan enzim dehidrogenase. 

Kehidupan hewan tingkat tinggi bergantung pada pasokan oksigen untuk respirasi, yaitu proses sel memperoleh ebergi dalam bentuk ATP dari reaksi terkendali hidrogen dengan oksigen untuk membentuk air.

Perubahan energi bebas akibat reaksi oksidasi-reduksi setara dengan kecenderungan reaktan mendonasikan atau menerima elektron. Perubahan ini disimbolkan sebagai "Delta G0". Secara numerik dapat juga dinyatakan sebagai potensial redoks, misalnya potensial elektroda hidrogen sebesar -0,42. Potensial elektroda diukur biasanya pada ph 7,0.

Pada proses oksidasi atau oksidasi-reduksi terdapat enzim yang sangat berperan yaitu enzim oksidoreduktase. Enzim ini diklasifikasikan menjadi empat kelompok, yaitu (1) Oksidase (2) dehidrogenase (3) hidroperoksidase (4) oksigenase.

Berikutnya akan dibahas berdasarkan cara kerja ke-4 klasifikasi enzim di atas.

Journal Reading 1

Journal Reading 1

Lack of apoptotic protease activating factor-1 expression and resistance to hypoxia-induced apoptosis in cervical cancer

Istilah dan penjelasannya

Hipoksia
Adalah berkurangnya kadar tekanan oksigen yang terjadi pada penyakit yang mengakibatkan berkurangnya “supply” oksigen, misalnya pada penyakit pembuluh darah akut atau kronik, penyakit paru dan kanker.
Hipoksia menginduksi transkripsi yang menyebabkan terjadinya fenotip tumor yang agresif.(1)


Gambar 1. Dalam kondisi hipoksia, hypoxia-inducible transcription factor (HIF)-1alpha difosforilasi dan distabilisasi melalui jalur sinyal onkogenik yang melibatkan SRC, RAS, protein kinase C dan phosphatidylinositol 3-OH kinase (PI3K). Dalam nukleus, HIF-1alpha juga dapat berinteraksi dengan faktor transkripsi seperti AP-1, ETS dan cyclic AMP-response-element-binding protein (CREB) untuk mengaktivasi transkripsi. RNA-binding proteins, seperti HuR, membantu stabilisasi mRNA101, 102. Gen aktivasi HIF-1alpha atau HIF-1alpha-activated genes termasuk didalamnya vascular endothelial growth factor (VEGF), yang mempromosikan angiogenesis; glucose transporter 1 (GLUT1), yang mengaktivasi transport glukosa; lactate dehydrogenase (LDH-A), yang terlibat dalam glycolytic pathway; dan erythropoietin (EPO), yang menginduksi erythropoiesis. HIF-1alpha juga mengaktivasi transkripsi nitric oxide synthase (NOS)103, yang mempromosikan angiogenesis dan vasodilasi.{Harris, 2002 #91}



Apoptosis
Apoptosis (dari bahasa Yunani apo = "dari" dan ptosis = "jatuh") adalah mekanisme biologi yang merupakan salah satu jenis kematian sel terprogram. Apoptosis digunakan oleh organisme multisel untuk membuang sel yang sudah tidak diperlukan oleh tubuh.
Apoptosis, secara klasik dibagi menjadi 2 jalur yaitu jalur ekstrinsik dan jalur intrinsik:
Jalur intrinsik --> sitokrom C --> caspases --> kematian sel
Jalur ekstrinsik --> death receptors --> caspases --> kematian sel

APAF-1 (Apoptosis protease activating factor 1)
merupakan protein yang berperan dalam memperbanyak release sitokrom c dari mitokondria dalam mengaktivasi caspase-9 dan dipercaya sebagai faktor yang penting dalam jalur intrinsik.(2)


Gambar 2. Pada gambar ini dapat dilihat posisi APAF-1 yang merupakan komponen penting jalur intrinsik, dan tidak secara langsung berhubungan dengan HIF-1 alpha.{Harris, 2002 #91}



Pembahasan:

Judul Penelitian
Dalam bahasa Indonesia berarti kurang lebih: Kurangnya ekspresi APAF-1 dan resistensi terhadap apoptosis pada kanker serviks yang diinduksi oleh hipoksia. Judul tersebut di atas berkesan cukup informatif dan menarik karena tidak terlalu panjang. Judul tersebut tergambar pada artikel secara keseluruhan.

Abstrak
Abstrak yang dibuat merupakan abstrak terstruktur, sudah tercakup dalam komponen IMRAD (Introduction, Methods, Results, Discussion). Abstrak secara keseluruhan cukup informatif, tidak lebih dari 250 kata.

Pendahuluan
Pendahuluan terdiri dari 2 paragraf, pada awalnya dituliskan peran hipoksia dalam progresi tumor padat. Diuraikan juga data yang ada mengenai hipoksia pada kanker serviks yang mempunyai hubungan dengan apoptosis dan keagresifan tumor. Paragraf pertama baru mengungkapkan latar belakang saja, alasan melakukan penelitian dituliskan pada paragraf kedua, dimana menurut penulis ini adalah penelitian pertama yang menyelidiki hubungan antara APAF-1 dengan tingkat PO2, dan apoptosis pada tumor ganas manusia. Tujuan, dan desain penelitian tidak ditulis pada pendahuluan. (Meskipun tujuan dituliskan pada abstrak) .Uraian dalam pendahuluan ditunjang oleh pustaka yang relevan. Bagian pertama atau pendahuluan tidak terlalu panjang dan berbelit. Tabel 1 yang merupakan karakteristik pasien dan tumor yang dipakai untuk pengukuran pO2 pretherapeutic, membuat pembaca jadi ingin membaca dahulu, sehingga sedikit mengganggu karena sebenarnya adalah bagian dari hasil penelitian. Penempatan tabel ini terlalu awal, sehingga pada saat orang mulai membaca hasil penelitian harus membuka halaman sebelumnya.

Metode dan teknik pemeriksaan
Pada bagian ketiga tulisan ini yaitu bagian materials, patients and methods, sudah disebutkan desain, tempat dan waktu penelitian. Sumber populasi terjangkau disebutkan. Namun kriteria inklusi dan eksklusi tidak disebutkan. Cara pemilihan subyek tidak disebutkan. Teknik pemeriksaan tidak dijelaskan secara rinci, tetapi disebutkan rujukannya sehingga penelitian dapat diulang oleh orang lain. Pada penelitian dengan konsekutif sampling ini pengukuran dilakukan tidak dengan cara tersamar. Pada penelitian ini sayangnya tidak dilakukan uji keandalan pengukuran (kappa).
Metode pemeriksaan yang dipakai:
pemeriksaan kadar hipoksia dengan mempergunakan jarum eppendorf
pemeriksaan ini merupakan pemeriksaan klasik yang membutuhkan presisi sangat tinggi, namun pemeriksaan ini dibantu dengan komputer sehingga lebih tinggi presisinya.
kelebihan pemeriksaan ini adalah pengukuran secara langsung pO2. Dimana sampai saat ini pengukuran petanda hipoksia seperti HIF-1 alpha, GLUT-1 ataupun CAIX masih diragukan ketepatannya. (3, 4) Nilai lebih berikutnya adalah melakukan biopsi langsung pada daerah yang diukur tekanan parsial O2 nya sehingga pemeriksaan apoptosis dan APAF-1 dilakukan pada area yang sama.
Kekurangannya adalah penelitian ini dilakukan dengan memilih area tumor yang akan diukur secara makroskopik menggunakan mata telanjang. Pemilihan area tumor ini dapat saja tidak tepat benar pada area yang paling hipoksia pada tumor padat. Area hipoksia pada suatu tumor padat tidak homogen(5).
Pemeriksaan apoptosis dengan TUNEL methods.
Pemeriksaan ini adalah mewarnai adanya produk akhir apoptosis yaitu DNA breaks. Pemeriksaan ini merupakan pemeriksaan apoptosis kuantitatif dan kualitatif yang banyak dipakai. Pemeriksaan lain yang dianggap sebanding bahkan lebih mudah adalah memakai caspase-3 labelling index,dimana dihitung ekspresi caspase-3 dalam persen. (6)
kelebihan pemeriksaan ini adalah sudah banyak tersedianya kit sehingga lebih mudah pelaksanaannya.
kekurangannya adalah lebih rumit dibandingkan dengan pemeriksaan caspase-3 labelling index.
Pemeriksaan APAF-1 dengan imunohistokimia
Pemeriksaan imunohistokimia mempunyai prinsip mendeteksi suatu protein dengan adanya reaksi antigen-antibodi.
Kelebihan pemeriksaan ini adalah dalam hal penghitungan dapat dilakukan dengan menghitung per sel yang positif mengekspresi suatu protein. Pada publikasi ini juga ditulis oleh peneliti bagaimana peneliti menganalisa hasil pewarnaan imunohistokimia, prosentase sel yang positif dari suatu lapang pandang serta dilihat intensitas kepositifan berdasarkan kuat tidaknya pewarnaan yang terlihat. Penilaian ini meskipun bersifat semikuantitatif namun merupakan suatu cara yang banyak dipakai dalam mendapatkan data kuantitatif ekspresi suatu protein.
Kelemahan metode ini adalah masih adanya subyektivitas pemeriksa sediaan dimana dapat saja pemeriksa menilai suatu intensitas pewarnaan ekspresi protein berbeda antara pemeriksaan pertama dan berikutnya. Cara untuk memperkecil subyektivitas hasil sudah dilakukan dengan cara analisa hasil imunohistokimia oleh 2 orang.


Penelitian ini mendapat ethical clearance, dan memperoleh ijin subyek penelitian. Rencana analisis, batas kemaknaan, metode dan cara perhitungan power penelitian dan software statistic yang digunakan dalam penelitian disebutkan dalam penelitian ini.

Hasil
Tabel deskripsi subyek penelitian sudah disertakan, hanya saja ditempatkan didepan. Pada tabel tersebut karakteristik subyek ditampilkan berdasarkan stadium tumor. Namun tabel tersebut berkesan kurang informatif terutama pada bagian yang menampilkan stadium berdasarkan pemeriksaan PA post operatif, dimana yang lazim sebenarnya adalah stadium berdasarkan FIGO (International Federation of Obstetrics and Gynecology), lalu menampikan grade tumor juga tidak informatif, apakah yang dimaksud adalah grade hasil pemeriksaan histopatologi atau bukan juga tidak jelas. Sehingga secara keseluruhan tabel ini tidak informatif. Dan bila ditelaah lagi adanya grade juga tidak penting dalam penelitian ini.
Semua hasil penelitian yang sesuai dengan tujuan penelitian disebutkan dalam hasil, sampai dengan hasil analisa survival. Subyek yang drop out dalam penelitian disebut. Hasil uji statistik di tulis lengkap dengan interval kepercayaan dan nilai p-nya. Dalam hasil penelitian tidak disertakan analisa penulis.

Diskusi
Hal yang dibahas relevan dengan tujuan penelitian. Sayangnya tidak sedikitpun dibahas keterbatasan penelitian dan kemungkinan dampaknya terhadap hasil, kesulitan penelitian. Analisa hasil pada penelitian ini disebutkan pada diskusi dengan kata kemungkinan, karena tidak didapatkannya hasil yang bermakna.

Daftar Pustaka
1. Harris AL. Hypoxia--a key regulatory factor in tumour growth. NatRevCancer. 2002;2(1):38-47.
2. Anichini A, Mortarini R, Sensi M, Zanon M. APAF-1 signaling in human melanoma. Cancer Lett. 2006 Jul 18;238(2):168-79.
3. Jankovic B, Aquino-Parsons C, Raleigh JA, Stanbridge EJ, Durand RE, Banath JP, et al. Comparison between pimonidazole binding, oxygen electrode measurements, and expression of endogenous hypoxia markers in cancer of the uterine cervix. Cytometry B Clin Cytom. 2006 Mar;70(2):45-55.
4. Mayer A, Hockel M, Vaupel P. Endogenous hypoxia markers in locally advanced cancers of the uterine cervix: reality or wishful thinking? Strahlenther Onkol. 2006 Sep;182(9):501-10.
5. Sobhanifar S, Aquino-Parsons C, Stanbridge EJ, Olive P. Reduced expression of hypoxia-inducible factor-1alpha in perinecrotic regions of solid tumors. Cancer Res. 2005 Aug 15;65(16):7259-66.
6. Duan WR, Garner DS, Williams SD, Funckes-Shippy CL, Spath IS, Blomme EA. Comparison of immunohistochemistry for activated caspase-3 and cleaved cytokeratin 18 with the TUNEL method for quantification of apoptosis in histological sections of PC-3 subcutaneous xenografts. JPathol. 2003;199(2):221-8.